Chromatographie

CC-BY-NC 4.0 / Joachim Herz Stiftung; Hanne Rautenstrauch

Beobachtung

1. Zunächst erscheint die Kieselgelplatte unverändert (Abb. 5, Bild 1). Durch das Aufsprühen der gelblichen Ninhydrin-Reagenz erscheint die Platte leicht gelb (Abb. 5, Bild 2). Nach dem Trocknen bzw. nach dem Erwärmen der Platte werden violette Flecken sichtbar (Abb. 5, Bild 3).
2. Bei genauerer Betrachtung kannst du beobachten, dass die Aminosäure Leucin (zweite von links auf der DC-Platte) beispielsweise weiter läuft als die Aminosäure Valin (dritte von links auf der DC-Platte). Am dichtesten an der Startlinie befindet sich der Fleck bei der Aminosäure Alanin (ganz links auf der DC-Platte).
3. An der Stelle, an der das Stoffgemisch aus den drei Aminosäuren aufgetragen wurde (ganz rechts auf der DC-Platte), werden drei violette Bereiche sichtbar, welche sich zum Teil überlappen. Die violetten Bereiche befinden sich jeweils auf derselben Höhe, wie eine der drei einzelnen Aminosäuren. So kannst du zuordnen, welcher Fleck von welcher Aminosäure stammt.

Ergebnis

1. Ninhydrin reagiert mit Aminosäurem zu einem blau-violetten Farbstoff namens Ruhemanns Purpur. Bei Ninhydrin handelt es sich um hydriertes Indan-1,2,3-trion \(\ce{(C_9H_4O_3)}\). Die Reaktionsgleichung siehst du in Abbildung 6.

   CC-BY-NC 4.0 / Joachim Herz Stiftung; Nadine Boele

2.  

   CC-BY-NC 4.0 / Joachim Herz Stiftung; Jan Cardell

   Dass die Aminosäuren unterschiedlich weit laufen ist mit Hilfe von Wechselwirkungen zum Fließmittel

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   und der Kieselgelplatte zu erklären. Das Alanin-Molekül (Abb. 7) hat mit drei Kohlenstoff-Atomen eine vergleichsweise kurze Kohlenstoff-Kette und läuft am wenigsten weit. Die Wechselwirkungen mit dem Fließmittel sind dementsprechend nicht so groß, daher bewegen sich die Alanin-Moleküle nicht so weit. Valin-Moleküle (Abb. 8) weisen im Vergleich dazu mit vier Kohlenstoff-Atome eine längere Kohlenstoff-Kette auf und haben zudem als weitere funktionelle Gruppe eine Methyl-Gruppe gebunden. Die längste Kohlenstoff-Kette hat das Leucin-Molekül (Abb. 9) mit fünf Kohlenstoffatomen, an welche ebenfalls eine Methyl-Gruppe gebunden ist. Von den drei untersuchten Aminosäuren hat Alanin den hydrophilsten und Leucin den hydrophobsten Charakter. Dass die Aminosäuren Leucin und Valin sich ähnlich weit bewegen, ist mit ihrem ähnlichen strukturellen Bau und dem Vorhandensein gleicher funktioneller Gruppen zu erklären. Sie unterscheiden sich

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   hauptsächlich in ihrer Kettenlänge. Moleküle mit längerer Kohlenstoff-Kette können beispielsweise mehr Van-der-Waals-Wechselwirkungen ausbilden. Leucin-Moleküle weisen die stärksten Wechselwirkungen mit dem Fließmittel auf und werden daher am weitesten transportiert.

3. Möchtest du dir die Reaktion bzw. die einzelnen Reaktionsschritte von einer Aminosäure mit Ninhydrin etwas genauer anschauen?

• Im ersten Schritt reagiert ein Molekül Ninhydrin unter Wasserabspaltung mit der Aminogruppe \(\ce{(-NH_2)}\) der Aminosäure zu einer sogenannten Schiff’schen Base, auch Azomethin genannt (Abb. 10). Unter Schiff’schen Basen verstehen wir im Allgemeinen Derivate von Aldehyden oder Ketonen, welche durch Kondensationsreaktionen mit Aminen entstehen. Schiff’sche Basen haben die allgemeine Summenformel \(\ce{R^1R^2C=NR^3}\). Bei \(\ce{R^3}\) handelt es sich im Falle einer Schiff’schen Base um einen organischen Rest. So auch hier beim Ninhydrin.

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• Im nächsten Schritt findet eine Decarboxylierung der Aminosäure statt. Das bedeutet, dass die Carboxygruppe der Aminosäure abgespalten wird (Abb. 11). Innerhalb des sich bildenden Moleküls finden Elektronenverschiebungen statt (Abb. 12).

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  Außerdem wird auch der Aminosäure-Rest durch eine Hydrolyse als Aldehyd abgespalten, sodass Amino-Ninhydrin entsteht (Abb. 13).

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• Das Amino-Ninhydrin reagiert nun in einer Kondensationsreaktion mit einem weiteren Ninhydrin-Molekül zu einem blau-violetten Farbstoff, der Ruhemanns Purpur genannt wird (Abb. 14). Die Farbe des Ruhemanns Purpur kommt durch die Mesomerie im Molekül unter Beteiligung von Wasserstoffbrücken im System der konjugierten Doppelbindungen zustande.

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Berechnung des Retentionsfaktors

Alle Aminosäuren erscheinen nach der Reaktion mit der Ninhydrin-Lösung violett durch die Bildung des Farbstoffes Ruhemanns Purpur. Anhand der Farbigkeit kannst du die Aminosäuren also nicht identifizieren. Um die Aminosäuren voneinander unterscheiden zu können, kannst du jedoch aus deinen beobachteten Werten den Retentionsfaktor \(\ce{(R_f-Wert)}\) für jede Aminosäure berechnen. Dazu benötigst du zum einen die Laufstrecke deines Fließmittels. Um diese zu bestimmen, misst du mit einem Lineal die Entfernung von der Startlinie bis zu dem Punkt, zu dem dein Fließmittel gelaufen ist. Als nächstes bestimmst du für jede der Aminosäuren die Laufstrecke, indem du jeweils die Entfernung von der Startlinie bis zur Mitte des violetten Punktes misst. Den RF-Wert berechnest du, indem du die Laufstrecke der Aminosäure durch die Laufstrecke deines Fließmittels teilst.

\(\ce{R_f = \dfrac{Laufstrecke\,der\,Aminosäure}{Laufstrecke\,des\,Fließmittels}}\)

In unserem Beispiel beträgt der Abstand von der Startlinie zur Fließmittelfront 4 cm. Die Laufstrecke des Alanins beträgt 1,28 cm, die von Leucin 3,35 cm und die von Valin 2,8 cm (Abb. 15).

Berechnung des Retentionsfaktor von Alanin:

\(\ce{R_f = \dfrac{Laufstrecke\,der\,Aminosäure}{Laufstrecke\,des \,Fließmittels} = \frac{1,28 cm}{4 cm}} = 0,32\)

Berechnung des Retentionsfaktor von Leucin:

\(\ce{R_f = \dfrac{Laufstrecke\,der\,Aminosäure}{Laufstrecke\, des \,Fließmittels} = \frac{3,35 cm}{4 cm}} = 0,8375\)

Berechnung des Retentionsfaktor von Valin:

\(\ce{R_f = \dfrac{Laufstrecke\,der\,Aminosäure}{Laufstrecke\,des \,Fließmittels} = \frac{2,8 cm}{4 cm}} = 0,675\)